新品丨Durashell氨基酸衍生分析方法包——多肽药物氨基酸比值分析

2024-12-20 14:56 来源：艾杰尔飞诺美

氨基酸分析是生命科学研究中最重要的技术之一。氨基酸是人体蛋白质的基本组成物质，除个别芳香族氨基酸外，紫外吸收均较弱，直接使用紫外检测器检测灵敏度低。故氨基酸分析通常需要选择合适的衍生试剂增加氨基酸的生色团，再使用紫外检测器进行检测。目前氨基酸衍生主要包括柱前和柱后衍生两种方法。

游离氨基酸的测定方法主要有柱前衍生反相色谱法、柱后衍生离子交换色谱法、离子色谱-积分脉冲安培检测法、液相色谱-蒸发光散射检测法、柱前衍生气相色谱法、衍生化毛细管电泳法、液相色谱-质谱联用法、超临界流体色谱法等，其中柱前衍生反相色谱法和柱后衍生离子交换色谱法为药品中氨基酸测定常用方法。

艾杰尔公司于2024年12月17日新推出的 Durashell AA 氨基酸分析方法是基于目前广泛使用的以 OPA（邻苯二醛）和 FMOC（9- 芴基甲基氯甲酸盐）为衍生剂的柱前衍生 HPLC 氨基酸分析方法。该方法具有简便、快速、准确、无需要手工衍生，可全自动化在线分析、衍生试剂无毒等优点，通过液相进样器自动衍生程序的设置，大大减少研究人员在衍生过程中的操作步骤及误差。

图 1. OPA 在巯基试剂存在下与一级氨基酸的衍生反应图

图 2. FMOC 与二级氨基酸的衍生反应图

同时，氨基酸分析也常用于测定蛋白质、多肽及其他药物制剂中氨基酸组成或含量。多肽作为由多个氨基酸通过肽键连接而形成的一类化合物，通常由 10~100 个氨基酸分子组成，连接方式与蛋白质相同，相对分子质量一般低于 10000。根据 2023 年 CDE 发布的《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行）》，在合成多肽原料药的质控考察项目中，氨基酸分析数据可用于计算多肽药物的氨基酸比值。氨基酸分析的水解方法可参考相关技术指南进行（例如《中华人民共和国药典》（2020 年版）第一增补本（四部）中新增“9120 氨基酸分析指导原则”）。

蛋白质或多肽样品中的氨基酸是以结合形式存在，必须经过水解处理，形成游离氨基酸后才能进行氨基酸测定。蛋白质或多肽的水解方法主要采用酸水解，同时辅以碱水解。其中，酸水解中使用广泛的是盐酸水解，所得其产生的氨基酸不消旋，但该方法引起会使一些氨基酸的被全部破坏或部分破坏，如色氨酸被全部破坏，丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸被部分破坏，门冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺分别转化为门冬氨酸和谷氨酸。对于这些氨基酸可采用较特殊的处理方法或者使其转变为稳定的形式，然后再进行盐酸水解。

以利那洛肽为例，在水解过程中加入二硫代二丙酸（DTDPA）以保护半胱氨酸，考察了酸性水解条件下各氨基酸的比值情况。

液相色谱分析

色谱柱：Durashell AA, 4.6*150 mm; 3 μm; 100 Å

柱温：45 ℃

波长：

一级氨基酸: 338 nm, 带宽 10 nm; 参比波长: 390 nm, 带宽 20 nm

二级氨基酸: 262 nm, 带宽 16 nm, 参比波长: 324 nm, 带宽 8 nm

狭缝：4 nm, 峰宽＞0.03 min

梯度洗脱程序：

时间/min	流动相 A%	流动相 B%	流速 mL/min
0	94	6	1.6
6	90	10	1.6
8	90	10	1.6
10	84	16	1.3
23	60	40	1.0
30	50	50	1.6
31	0	100	1.6
34	0	100	1.6
35	94	6	1.6
38	94	6	1.6

安捷伦进样器自动衍生程序

序号	进样器程序	衍生用试剂的分装与放置位置
1	从 1 号瓶中吸取硼酸盐缓冲液 5 μL	往 2 mL 进样瓶中加入 1 mL 硼酸盐缓冲液，加带密封垫的螺旋盖，密封，置于进样器样品架的 1 号位置
2	从样品瓶中吸取样品 2 μL	衍生用氨基酸标准溶液及样品溶液置于进样器样品架的 8-100 号位置
3	在空气中以最大的速度混合 7 μL，6 次	_
4	等待 0.5 分钟	_
5	从 2 号瓶中吸取水 0 μL	向 2 mL 样品瓶中加入 2 mL 水，加不带密封垫的螺旋盖，置于进样器样品架的 2 号位置
6	从 3 号瓶中吸取 OPA 衍生剂 1 μL	向带内插管的棕色样品瓶中加入 200 μL OPA 衍生试剂，加带密封垫的螺旋盖，密封，置于进样器样品架的 3 号位置
7	在空气中以最大的速度混合 8 μL，6 次	_
8	从 6 号瓶中吸取水 0 μL	向 2 mL 样品瓶中加入 2 mL 水，加不带密封垫的螺旋盖，置于进样器样品架的 6 号位置
9	从 4 号瓶中吸取 FMOC 衍生剂 1 μL	向带内插管的棕色样品瓶中加入 200 μL FMOC 衍生试剂，加带密封垫的螺旋盖，密封，置于进样器样品架的 4 号位置
10	在空气中以最大的速度混合 9 μL，10 次	_
11	从 7 号瓶中吸取 50 % 乙腈溶液 0 μL	向 2 mL 样品瓶中加入 50% 乙腈溶液 2 mL，加不带密封垫的螺旋盖，置于进样器样品架的 7 号位置
12	从 5 号瓶中吸取稀释剂 32 μL	向 2 mL 样品瓶中加入稀释剂 2 mL，加带密封垫的螺旋盖，密封，置于进样器样品架的 5 号位置
13	在空气中以最大的速度混合 41 μL，8 次	_
14	进样	_

辅助：

吸液速度：200 μL/min

喷液速度：600 μL/min

吸液位置：0.0 mm

注意：如果一次测定样品数较多，需长时间连续分析，建议按样品运行次数及时更换 5 号瓶中的稀释剂及 2、6、7 号瓶中清洗进样针外壁的溶剂。

表 1. 混合氨基酸对照溶液保留时间

氨基酸名称	英文缩写	保留时间/min
门冬氨酸	Asp	1.269
谷氨酸	Glu	1.695
丝氨酸	Ser	4.989
组氨酸	His	6.885
甘氨酸	Gly	7.814
苏氨酸	Thr	8.546
半胱氨酸	Cys-X	9.613
精氨酸	Arg	11.563
丙氨酸	Ala	12.775
酪氨酸	Tyr	15.633
缬氨酸	Val	19.574
甲硫氨酸	Met	19.918
正缬氨酸	Nva（内标）	20.695
苯丙氨酸	Phe	22.470
异亮氨酸	Ile	22.966
亮氨酸	Leu	24.202
赖氨酸	Lys	24.703
肌氨酸	Sar（内标）	29.484
脯氨酸	Pro	30.518

图 3. 混合氨基酸对照溶水解液相色谱图（一级氨基酸）

图 4. 混合氨基酸对照溶液水解液相色谱图（二级氨基酸）

图 5. 利那洛肽水解溶液液相色谱图（一级氨基酸）

图 6. 利那洛肽水解溶液液相色谱图（二级氨基酸）

表 2. 利那洛肽样品溶液 110 ℃ 下水解测试数据

氨基酸比值
氨基酸名称	英文缩写	测试值	要求范围
门冬氨酸	Asp	1.06	0.85-1.15
谷氨酸	Glu	1.00	0.85-1.15
甘氨酸	Gly	1.00	0.85-1.15
苏氨酸	Thr	0.99	0.85-1.15
半胱氨酸	Cys-X	5.85	5.1-6.9
丙氨酸	Ala	0.94	0.85-1.15
酪氨酸	Tyr	1.66	1.7-2.3
正缬氨酸	Nva（内标）	_	_
肌氨酸	Sar（内标）	_	_
脯氨酸	Pro	0.95	0.85-1.15

表 3. 利那洛肽样品溶液 150 ℃ 下水解测试数据

氨基酸比值
氨基酸名称	英文缩写	测试值	要求范围
门冬氨酸	Asp	1.02	0.85-1.15
谷氨酸	Glu	0.98	0.85-1.15
甘氨酸	Gly	1.00	0.85-1.15
苏氨酸	Thr	0.98	0.85-1.15
半胱氨酸	Cys-X	6.28	5.1-6.9
丙氨酸	Ala	0.99	0.85-1.15
酪氨酸	Tyr	1.89	1.7-2.3
正缬氨酸	Nva（内标）	_	_
肌氨酸	Sar（内标）	_	_
脯氨酸	Pro	1.07	0.85-1.15

结果表明，利那洛肽经酸性水解后进行各氨基酸比值分析与理论值相符，该方法可作为多肽类药物水解后经衍生检测氨基酸比值的手段，同时，建议根据不同多肽氨基酸组成优化水解温度、时长及巯基保护试剂以获得更好结果。

关键词：游离氨基酸

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