手机版
化工仪器网手机版
化工仪器网小程序
官方微信
公众号：chem17
扫码关注视频号
细胞培养的步骤有哪些
2022年12月01日 18:51
来源：爱必信（上海）生物科技有限公司
细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。
细胞培养的步骤
1、复 苏
细胞复苏的原则：快速融化
必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
实验前准备
将水浴锅提前预热至37℃。
细胞实验室进行常规消毒，用75%酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。
在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。
取出冻存管
根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。
从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
迅速解冻
迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
约1-2min后冻存管内液体溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
平衡离心
用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3分钟。
制备细胞悬液
吸弃上清液。
向离心管内加入适量培养液，吹打制成细胞悬液。
用培养液悬液混悬沉淀细胞，细胞计数调整细胞浓度，放入培养箱中培养。
细胞计数
细胞浓度以5×105/ml为宜。
培养细胞
将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃，5%CO2的培养箱内2-4h(或者24-48h)后换液继续培养培养，换液的时间根据细胞情况而定。
记录复苏日期
2、传 代
01、传代密度过高
一旦细胞养太久至融合度过高(>90%)才传代，容易使细胞产生老化现象，甚至是堆叠，再消化细胞时不易吹打成单颗细胞，即便再重新铺盘传代，细胞也无法回到原本的特性了。(如：单层细胞，没长满就发生堆叠现象)。
解决方案
尽量避免融合度过高，镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。
细胞融合度：在细胞培养中指的是细胞在培养表面(培养皿/瓶)所占的比例。
02、传代密度过低
哺乳动物贴壁培养细胞，若细胞培养到80-90%密度需要开始传代，在传代接种细胞密度过低，细胞间距离太远，就无法在细胞间产生黏附及通信作用，帮助信号传导并活化细胞；总体细胞量不足，分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境，以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。
解决方案
细胞传代时，要进行准确的细胞计数，确保铺盘的密度。
3、冻 存
细胞冻存的基本原理：慢冻
手动降温：将细胞依序放在4℃(30分钟)、-20℃(1小时)、-80℃(过夜)后移至液氮中保存。
程序降温盒：是一般广泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器(填充异丙醇或依靠特制金属导热)，使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃(过夜)，然后移至液氮中保存。
由此可以看出，程序降温精准度更高，优于手动降温。
部分低温保护剂在缓慢冷冻过程中虽然会保护细胞，但它们也会引起细胞毒性，尤其是在室温下。因此，在标准的自制冻存液中，会含有血清，血清是用来降低细胞毒性的，但血清也不是完整的。
免责声明
- 凡本网注明“来源：化工仪器网”的所有作品，均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-化工仪器网合法拥有版权或有权使用的作品，未经本网授权不得转载、摘编或利用其他方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的，应在授权范围内使用，并注明“来源：化工仪器网”。违反上述声明者，本网将追究其相关法律责任。
- 本网转载并注明自其他来源（非化工仪器网）的作品，目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点和对其真实性负责，不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时，必须保留本网注明的作品第一来源，并自负版权等法律责任。
- 如涉及作品内容、版权等问题，请在作品发表之日起一周内与本网联系，否则视为放弃相关权利。
最新产品
采购中心
