神经元-神经胶质细胞和免疫细胞的细胞共培养步骤

神经元-神经胶质细胞和免疫细胞的细胞共培养步骤如下：

1将hPSC分化为星形胶质细胞

1.按照STEMdiff™星形胶质细胞分化和成熟试剂盒使用说明中概述的胚状体（EB）或单层方案进行操作。

2.星形胶质细胞成熟阶段：星形胶质细胞在STEMdiff™星形胶质细胞成熟培养基中培养至少3周。

3.通过对培养的细胞亚群进行免疫细胞化学分析来验证星形胶质细胞分化是否成功。按照STEMdiff™星形胶质细胞分化试剂盒使用说明，细胞群应大于70% S100ꞵ+、大于60% GFAP+和低于15% ꞵIII-tubulin或双皮质素（DCX）阳性。

2 将hPSC分化为小胶质细胞

1.按照STEMdiff™造血试剂盒使用说明中概述的方案生成造血祖细胞（HPC）。

2.过流式细胞术评估HPC分化效率。所得细胞群应大于90% CD43+ 和大于20% CD34/CD45共阳性。

3.按照STEMdiff™小胶质细胞分化和成熟试剂盒使用说明的A部分（小胶质细胞分化）中概述的步骤1-8进行操作。

4.通过流式细胞术评估小胶质细胞分化的效率。所得细胞群应超过80%为CD45和CD11b共阳性。

5.可选步骤：在第五部分的共培养之前，可以使用STEMdiff™小胶质细胞成熟试剂盒进一步培养小胶质细胞，但小胶质细胞分化后的额外培养总时间不得超过10天（成熟期和共培养期的总和）。

3将hPSC分化为前脑神经元

1.根据STEMdiff™前脑神经元分化和成熟试剂盒使用说明中概述的胚状体（EB）或单层方案进行操作。

注：将神经元前体细胞接种到STEMdiff™前脑神经元成熟培养基中（使用说明C部分第1步）时，星形胶质细胞和小胶质细胞共培养的建议密度范围为1.5 x 104 - 4 x 104细胞/cm2。最佳密度根据实际情况相应调整。

2.前脑神经元成熟阶段：神经元在STEMdiff™前脑神经元成熟培养基中培养至少7天。

3.通过对培养的细胞亚群进行免疫细胞化学分析来验证前脑神经元分化是否成功。所得细胞群ꞵIII-tubulin和FOXG1的阳性率应大于90%，星形胶质细胞标志物GFAP的阳性率应低于10%。

4建立前脑神经元-星形胶质细胞共培养

1.按照STEMdiff™星形胶质细胞试剂盒的使用说明的C部分（星形胶质细胞成熟）的步骤1-5从第一部分中分离成熟的星形胶质细胞。

注：将细胞重新悬浮在1 mL STEMdiff™星形胶质细胞成熟培养基中，然后使用台盼蓝和血细胞计数器进行细胞计数。

2.在STEMdiff™星形胶质细胞成熟培养基中稀释细胞悬浮液，以获得所需的细胞浓度和体积。

注：星形胶质细胞悬浮液的浓度和体积应自行优化，并取决于所需的星形胶质细胞与神经元的细胞类型比率、使用的培养孔数量以及第三部分第1步中接种的前脑神经元前体的初始细胞密度。推荐进行共培养时星形胶质细胞与前脑神经元的比率为1:1。

3.取出并弃去第三部分中前脑神经元生成的培养基。

4.将步骤2中制备的悬浮星形胶质细胞接种到前脑神经元上，并在STEMdiff™星形胶质细胞成熟培养基中培养过夜。继续第五部分。

5建立共培养体系

1.在BrainPhys™的使用说明中，按照“分化培养基的制备”（B部分）的说明制备所需体积的BrainPhys™神经元培养基和添加物。

注：所需培养基的量取决于培养板的形式和所需的共培养的周期。

2.将STEMdiff™小胶质细胞添加物2在室温下解冻或者在2-8°C下过夜。充分混合。

注：如果不立即使用，请分装并储存在-20°C下。请勿超过标签上标明的有效期 (EXP)。另外，该组分可单独购买。

3.按照以下步骤制备优化的共培养基：

a. 将STEMdiff™小胶质细胞添加物2添加到BrainPhys™神经元培养基和添加物中，直至最终浓度为1X（如每10 mL培养基添加40 µL添加物）。

b. 充分混合。

注：如果不立即使用，培养基存放在2-8°C下最多2周。

4.从第二部分收集小胶质细胞：

a. 将整个细胞悬浮液转移到15 mL离心管中。为收集尽可能多的细胞，可以使用含有15 mM HEPES的温热DMEM/F-12进行清洗。

b . 以 300 x g转速离心5分钟。

c . 去除上清液，并将沉淀物重新悬浮在适当体积的共培养基中。

d . 使用台盼蓝和血细胞计数器计数细胞。

5.在新的共培养基中稀释小胶质细胞悬浮液，以获得所需的最终细胞浓度和体积。

6.取出并丢弃第四部分中产生的前脑神经元 - 星形胶质细胞共培养物的培养基。

7.将重新悬浮的小胶质细胞接种到共培养的前脑神经元和星形胶质细胞上。

8.将培养板放入37°C、5% CO2培养箱中。通过快速、短暂地前后和左右移动培养板，使细胞分布均匀。

9.每2-3天使用共培养基进行半换液。

注：小胶质细胞是半粘附的，在更换培养基时可能会被移除。在进行半换液之前，将板放入带有板适配器的吊桶式离心机中，以100 x g的速度离心2分钟，使细胞沉降。

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