XTerra色谱柱怎么连接到HPLC系统

XTerra色谱柱怎么连接到HPLC系统

a.色谱柱的连接

需要的工具:3/8英寸扳手和5/16英寸扳手各一个

  请避免在硬物上敲击色谱柱或将色谱柱从高处掉落，这样可能会造成柱床断裂，影响柱性能。

  使用外径 1/16英寸的不锈钢管连接色谱柱，只有不锈钢管与色谱柱接头的末端完全吻合，没有死体积或漏液的情况，才能获得最好的分离效果。当需要拧紧或拧松色谱柱连接时，请将5/16英寸的扳手置于不锈钢管的螺丝位置，将3/8英寸的扳手置于色谱柱端口的六面体位置。

  沃特世公司的色谱柱具有Parker和Waters两种不同型式的接头，因此与之连接的管路的锥箍也有两种型式。如图1所示:Waters型式的接头要求露出锥箍的不锈钢管路长度为0.130英寸，而Parker型式的接头则要求露出锥箍的不锈钢管路长度为0.090英寸。

  只有在管路与色谱柱正确连接的系统中，管路与色谱柱接口末端完全吻合，没有死体积，才能获得最好的分离效果。

  Parker接头与Waters型式色谱柱连接会产生死体积，而流路中死体积的存在必然降低色谱柱的柱效。解决这种问题的办法是:切掉原来的锥箍接头，用一个新的锥箍连接到管路上做成一个新的接头。请注意:在拧紧螺丝前，要保证露出锥箍的不锈钢管路长度和新的色谱柱接口匹配。

  Waters接头与Parker型式色谱柱连接时，在锥箍与色谱柱接口完全吻合之前，不锈钢管路就已经顶到了色谱柱接口的末端。这样，锥箍与色谱柱接口之间会留下缝隙而产生漏液。解决这类问题的方法有两种:

1)用力拧紧不锈钢管路上的螺丝时锥箍前移与柱接口完全吻合。请注意:用力不可过大以免损坏柱接口或将不锈钢管拧断。

2)切掉原先的锥箍接头，将一个新的锥箍连接到管路上做一个新的接头。

  用沃特世公司一件式或两件式PEEK接头(PSL613315一件式或PSL613322和PSL613316的两件式接头)代替传统的不锈钢压紧螺丝可以解决上述两类问题，因为PEEK接头允许自由调节露出锥箍之外的不锈钢管路长度，而且可以手动拧紧，简单方便。更方便的选择是使用SLIPFREE连接器，它具有如下特点:

●可将管路推入接口，保证无死体积连接

●手紧后即可耐受10,000 psi压力

●拆开连接后可以重新适应新的色谱柱接口，与所有商品化的接口兼容

●不锈钢合金表面稳定性好，且没有颗粒物质产生

●独特的设计将固定作用与密封作用分开

b.测量系统的谱带扩展体积以及系统偏差

  图6说明了管路内径对系统谱带扩展和峰形的影响，可以看出，大内径的连接管路会产生更大的谱带扩展，灵敏度更低。

以下将介绍如何测量系统的谱带扩展体积和系统偏差。

  注意:测试需要在配置单波长紫外检测器的HPLC系统上进行(不要用二极管矩阵检测器)

a)取下色谱柱，换上一个零死体积的两通

b)将泵流速设为1ml/min

c)用流动相将测试混合物稀释，使检测器灵敏度达0.5~1AUFS(可使用包含尿嘧啶、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯的混合物，沃特世订货号WAT034544)

d)进样2~5μL

e)测量4.4%峰高处的峰宽(5-sigma方法):

5-sigma 谱带扩展体积(μL)=峰宽(min)×流速(ml/min)×(1000μL/1ml)

系统偏差(μL²)= (5-sigma展宽²)/25

典型的HPLC系统谱带扩展体积应该在70μL至130μL之间(或偏差400μL²±36μL²)，对于使用微径柱(如2.1mmI.D.的色谱柱)的系统，谱带扩展体积不得超过20~40μL(或偏差不得超过16μL²~64μL²)。

c.测量梯度延迟体积(或滞后体积)

  为了成功地进行梯度方法的转移，需要在两台仪器上用相同的方法测试梯度滞后体积。如下列出了测量梯度滞后体积的方法:

a)取下色谱柱，换上一个零死体积的两通

b)准备流动相A(纯溶剂，如甲醇)和流动相B(流动相A中加入有UV吸收的样品，如含0.1%(v/v)丙酮的甲醇溶液)

c)用流动相A平衡系统直到基线平稳

d)设定检测器波长，以待测物的最大吸收为准(丙酮采用265nm)

e)流速设为2mL/min，编辑一个10分钟内0~100%B的线性梯度(具体的条件可以适当调整，但需要保证梯度体积不低于20mL)，然后保持100%B，采集数据f)首先测量50%吸光度处对应的梯度中点时间t1/2(在起始和最终等度区间的基线之间的垂直距离的一半处,如图8所示)

g)将梯度中点时间t1减去梯度时间t。的一半(本例为5分钟)即可得到梯度滞后时间t。

h)将梯度滞后时间t_D乘以流速(2ml/min)即可得到滞后体积V_D

  提示:对快速梯度方法来讲，梯度滞后体积不得超过1mL，如果超过1mL，请参考系统优化建议部分的内容来减小系统体积。