细胞培养的无菌操作基本技术

细胞培养是一项需要严格无菌操作的实验技术，以下是关于细胞培养的无菌操作基本技术、实验用品、培养基、抗生素和血清等方面的总结。

一、无菌操作基本技术

1. 实验前准备：

   - 无菌室及无菌操作台以紫外灯照射 30 - 60 分钟灭菌，用 70% 乙醇擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转 10 分钟后开始实验操作。

   - 每次操作只处理一株细胞株，不共享培养基，避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，用 70%乙醇擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转 10 分钟以上，再进行下一个细胞株操作。

2. 操作区域要求：

   - 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品可暂时放置，其它实验用品用完即移出，以利于气流流通。

   - 实验用品以 70%乙醇擦拭后带入无菌操作台，实验操作应在台面中央无菌区域，勿在边缘非无菌区域操作。

3. 取用物品注意事项：

   - 小心取用无菌实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，不在打开的容器正上方操作实验。

   - 容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约 45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4. 工作人员安全：

   - 工作人员应穿戴实验衣及手套后进行实验。对于来自人类或病毒感染的细胞株应特别小心操作，并选择适当等级的无菌操作台（至少 Class II）。

   - 操作过程中，避免引起 aerosol 产生，小心毒性药品如 DMSO 及 TPA 等，避免尖锐针头伤害。

5. 定期检测项目：

   - 检测 CO2 钢瓶的 CO2 压力。

   - 检测 CO2 培养箱的 CO2 浓度、温度及水盘是否有污染（水盘的水用无菌水，每周更换）。

   - 检测无菌操作台内的 airflow 压力，定期更换紫外线灯管及 HEPA 过滤膜、预滤网（300 小时/预滤网，3000 小时 /HEPA）。

6. 水槽处理：

   - 水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750），定期更换水槽的水。

二、实验用品

1. 种类：

   - 细胞培养实验用品均为无菌，除玻璃容器与 pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。

   - TC 级培养盘表面有 coating 高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有 Tflask 、plates、dishes、roller bottle 等，依实验需要使用。

   - 塑料无菌吸管：1 ml、2 ml、 5 ml、10 ml、25 ml。

   - 塑料离心管：15 ml、50 ml，有两种不同材质， polypropylene（PP）为不透明材质，polystyrene（ PS ）为透明材质，可依实验需要选择。

   - glass pastuer pipet：9 inch，用于抽掉废弃培养液等。

   - 玻璃血清瓶：100 ml、250 ml、 500 ml、1000 ml。

2. 清洗：

   - 新购玻璃血清瓶先以 0.1 - 0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后使用。

   - 用过的玻璃血清瓶，高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。

3. 灭菌：

   - 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌 121 oC，15 lb ，20 分钟，置于 oven 中烘干。

   - 实验用玻璃 pasteur pipet 以干热灭菌 170 oC ，4 小时。

   - 液体或固体废弃物可用 10% hypochloride 溶液（次氯酸，即漂白水）或蒸汽高压灭菌 121 oC ，15 lb，20 分钟处理。

三、培养基

1. 贮存与使用：

   - 液体培养基贮存于 4 oC 冰箱，避免光照，实验进行前放在 37 oC 水槽中温热。

   - 液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间 glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可添加适量 glutamine 。

2. 粉末培养基配制：

   - 粉末培养基之配制体积为 900 ml，pH 为 7.2 - 7.4，须添加 10%血清。NaHCO3 为另外添加，应分别溶解粉末培养基及 NaHCO3 粉末后再混合，用 CO2 气体调整 pH。

   - 材料包括纯水、粉末培养基、NaHCO3、电磁搅拌器、无菌血清瓶、无菌过滤膜、pH meter 、真空帮浦、CO2 气体等。

   - 步骤为溶解粉末培养基、溶解 NaHCO3 粉末并通入 CO2 气体至饱和、混合两种溶液、调整 pH、过滤灭菌、分装并贮存于 4 oC，同时配制之培养基需作生长试验与污染测试。

3. 配制培养基之生长测试：

   - 材料有 MDCK cell、6-well TC plate 、methanol、glacial acetic acid、10% Giemsa solution 。

   - 步骤包括培养 MDCK cell、观察细胞群落生长、固定细胞、染色、计数群落数并比较，若新配制或新批号培养基对细胞生长不佳则丢弃。

四、抗生素

1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素，培养自 ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素；培养自其它实验室引进之细胞株，制作 token freeze 前培养基须添加抗生素，通过污染测试后大量培养时不加抗生素。

2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个 flask 时，则须添加抗生素（penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml ）。

3. 若要检测 mycoplasma，则培养基内不可添加 gentamicin，因 gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。

4. 去除细菌污染之抗生素混合配方为 penicillin 250 units/ml，streptomycin 250 ug/ml ，neomycin 250 ug/ml，bacitracin 2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。

5. 表中列出了不同抗生素的使用种类、工作浓度、储存温度及杀灭细菌类型。

五、血清

1. 贮存要求：

   - 血清必须贮存于–20 ～ -70 oC，若存放于 4℃，请勿超过一个月。

   - 可将血清分装于无菌 50 ml 离心管中，预留血清结冻时体积增加约 10% 的空间，否则易发生污染或容器冻裂。

2. 处理方法：

   - 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。

3. 解冻步骤：

   - 瓶装血清采用逐步解冻法，从–20 oC 或–70 oC 至 4 oC 冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，溶解过程中须规则摇晃均匀，勿直接由–20 oC 直接至 37 oC 解冻。

4. heat-inactivation：

   - 指 56 oC，30 分钟加热已解冻之血清，目的是使血清中之补体成份去活化，除非必须，一般不建议作此热处理，会造成沉淀物增多且影响血清品质。

5. 注意事项：

   - 勿将血清置于 37 oC 太久，否则血清会变得混浊，影响血清品质。

6. 血清之沉淀物：

   - 凝絮物：由血清中之脂蛋白变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白造成，可用离心去除，或离心后上清液加入培养基中一起过滤，不建议用过滤步骤去除，以免阻塞过滤膜。

   - 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理的血清沉淀物会显著增多，这些小黑点一般不会影响细胞生长，但若怀疑血清品质，应立即停用，更换另一批号血清。

7. 血清之生长测试：

   - 材料有 MDCK cell、a-MEM、 6-well TC plate、methanol、glacial acetic acid 、 10% Giemsa solution。

   - 步骤包括培养 MDCK cell 至 80% confluency 、处理细胞制成悬浮液并测浓度、接种细胞入 6-well plate 并加入不同浓度血清的 a-MEM、培养、固定、染色、计数群落数、计算 SPE 和 RPE，比较各浓度血清培养基之 RPE，可知待测血清对细胞生长的影响。同时，可订购多量同一批号的优良血清，置于– 70 oC 保存。

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