【飞诺美色谱】色谱小知识 | 准确配置流动相的重要性

原文作者– Helen Whitby, PhD

翻译作者- Kevin Zhao, M.S., MBA

缓冲溶液是指由弱酸及其共轭碱（或弱碱及其共轭酸）所组成的缓冲对配制的，且能够在加入少量强酸或强碱时，可以有效减缓pH值改变的水溶液。缓冲溶液能帮助维持分析方法的稳定，而不会因为微弱的环境改变的情况下而造成分析结果的改变。

缓冲溶液是被用来维持pH值的稳定。它们是通过维持弱酸及其共轭碱的平衡从而防止了pH值的改变。

缓冲溶液是如何工作的？

根据Le Chatelier原理，当一些强酸 (或者更多的氢离子“H+”) 加入到弱酸及其共轭碱的平衡混合物中时，平衡会被向左移动。同样，如果在混合物中加入强碱，氢离子浓度下降的幅度会小于所预期加入碱的量。

当配制缓冲溶液时你应该遵循以下几个原则

• 在配制缓冲液前，建议用定值校准缓冲液标准品来校对电子pH计

• 根据所需缓冲液的浓度，精确地称出所需缓冲盐的重量

• 把所需的缓冲盐加到已经装有HPLC色谱级超纯水的容量烧瓶中，并充分搅拌至溶解

• 使用pH探针或pH计去测量溶液的pH值

• 通过添加少量的强酸或强碱，将容液的pH值调整至所需的值

• 调整至所需pH值后，将溶液用色谱级超纯水稀释至最终的所需体积容量，并混合均匀

HPLC缓冲液通常用于控制在液相色谱分析中所不希望出现的二次相互作用。此外，缓冲液也被用来工作分析物的电离状态，以确保分析物不会同时出现一个以上的电离状态。

化合物的pKa值代表此化合物的50%离子化和50%中性时的pH值。如果在此pH值下分析此化合物，你会看到分裂峰的出现或者不稳定的保留时间。因此，我们建议所有的分析方法的pH值都应该控制在目标分析化合物的pKa值正负两个pH单位以上。

当配制等度流动相的时候，我们还需要考虑以下几个因素来确保方法的稳定

• 尽可能提前预混合你所使用的流动相，因为这将防止经过泵混合流动相时会出现的错误

• 每一次都需要始终使用相同的配制方法及流程。例如，如果你方法是先加水，那你每次都必须是先加水。如果你是先测定单独的成分然后再混合，那你就必须每次都按这个流程来做。记得千万不要改变这一个固定的配制流程，因为这个配制流程的改变让分析物的保留时间可能出现很大的改变

以下的这个实验例子展示了当流动相用以下不同的方式来混合时，峰保留时间可能出现的改变

方法一

先加水：先用量筒量400毫升的水并倒进1升的容量瓶中，然后用甲醇稀释至容量瓶的刻度

方法二

先加甲醇：先用量筒量600毫升的甲醇并倒进1升的容量瓶中，然后用水稀释至容量瓶的刻度

方法三

甲醇和水各自先量好：先用量筒量600毫升的甲醇并倒进流动相瓶中，然后用同样的量筒量400毫升的水并倒进已经装有甲醇的流动相瓶中

方法四

让液相的泵来混合A瓶中的水和B瓶中的甲醇

缓冲液的浓度也是很重要的。我们一般认为，10mM以下的浓度不足够提供可以控制化合物硅醇活性或者电离状态所需要的缓冲能力，因此10mM是反相或者HILIC色谱模式下的低有效浓度。对于其他色谱模式，如体积排阻色谱就需要更高的缓冲液浓度，使用超过100mM浓度的缓冲液在体积排阻色谱法中并不罕见。

缓冲液的浓度必须非常精确地平衡好，以确保在所有的条件下都能达到溶解。在反相条件下，如果方法条件是包含了高比例有机相的话（例如跨度很大的梯度），则很有可能需要控制缓冲液的浓度，以确保不会出现缓冲盐的析出。

当开发一个可靠稳定的HPLC方法时，流动相的贡献跟色谱柱固定相的选择性一样重要，另外流动相的选择与配制跟色谱柱固定相批次间的质检也是一样重要的。