ibiPoreSiN玻璃膜上人类内皮细胞在剪切力环境下的培养方案

　　本应用说明是在µ-Slide ibiPore SiN载玻片内创建单层人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的方案。在涂层和细胞接种后，使用ibidi pump system泵系统/流体剪切力系统将内皮单层暴露于单向层流剪切应力下。该方案的重点是将µ-Slide ibiPore SiN与使用ibidi pump system泵系统施加剪切应力相结合。

　　ibidi用于研究动态或静态条件下迁移和传输的解决方案：

　　• µ-Slide ibiPore SiN

　　• ibidi Pump System

　　相关文件：

　　•Instructions µ-Slide ibiPore SiN

　　•Instructions ibidi Pump System

　　1、材料

　　•µ-Slide ibiPore SiN 0.5μm/20% ibiTreat (货号：85216-S,ibidi,德国)

　　•ibidi Pump System泵系统 (货号：10902.ibidi,德国)

　　•灌流管套装红色，15cm,内径1.6mm (货号：10962.ibidi,德国)

　　•螺旋式管道夹 (货号：10861.ibidi,德国)

　　•人脐静脉内皮细胞，HUVEC,(货号：C-12203.PromoCell,德国)

　　•内皮细胞生长培养基(货号：C-22010.PromoCell,德国),辅以内皮细胞生长培养基补充混合液(货号：C-39215.PromoCell,德国)

　　•Accutase细胞解离液(货号：A1110501.Gibco)

　　•IV型胶原蛋白(货号：354233.Corning)

　　•标准细胞培养设备(无菌工作台、细胞培养箱、培养瓶、PBS等)

　　重要提示：在实验前一天，将所有所需材料(如 µ-Slides 载玻片、培养基和灌流管(套装)在37°C和5%CO2的培养箱中平衡过夜，这对防止气泡随时间产生至关重要。

　　2、包被载玻片

　　•按照生产商的说明，将IV型胶原蛋白涂层溶液稀释至40µg/mL的最终浓度

　　•在 µ-Slide 载玻片上涂上一层涂层 (详细的涂层方案见 µ-Slide ibiPore SiN 使用说明)

　　•吸干涂层溶液

　　•用PBS冲洗两次

　　•在室温下晾干 µ-Slide 载玻片，然后再接种细胞

　　3、制备及接种细胞

　　•在添加了混合补充剂的内皮细胞生长培养基中培养HUVEC

　　•用 Accutase 细胞解离液处理细胞2分钟，使其分离

　　•收集细胞悬液

　　•离心细胞悬浮液，用生长培养基稀释以获得所需的浓度

　　•计数细胞，调整至2x106 cells/ml的浓度，使细胞贴壁后的光学汇合度达到100%

　　• 将细胞接种到 μ-Slide ibiPore SiN 的下部通道中(细胞播种的详细说明请参阅μ-Slide ibiPore SiN使用说明)。

　　•在37°C和5%CO2条件下培养两小时，让细胞贴壁。

　　重要提示：用于繁殖的培养的内皮细胞不应生长到接近100%的光融合。融合的单层进入生长抑制状态，这会阻止细胞增殖并改变细胞的生理机能。只有在需要单层培养的实验中，才建议采用100%汇合。

　　4、灌注

　　•在相差显微镜下控制细胞贴壁的程度

　　•为清除 ibidi Pump System 泵系统中的气泡，在连接 μ-Slide ibiPore SiN载玻片前，先让其运行1-2小时

　　重要提示：实验当天如何清除系统中的气泡，请参阅ibidi Pump System泵系统使用说明

　　•用 ibidi 螺旋式管道夹或霍夫曼管道夹夹住灌流管的管道

　　•将 µ-Slide ibiPore SiN载玻片连接到管道上

　　•缓慢打开夹紧的管道，以尽量减小压力峰值

　　•按照下表中的参数开始灌注实验。开始时低流量是使细胞适应剪切应力的必要条件

　　5、结果

　　人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在 ibidi μ-Slide ibiPore SiN 0.5μm 载玻片中以 10dyne/cm²流体剪切力条件下培养(A)和静态条件下(B)培养24小时，窗口大小2mm×2mm，4倍物镜，相差，比例尺200µm