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BioZen MagBeads精准捕获ADC“药王”（DS-8201）
抗体偶联药物（antibody-drug conjugate，ADC）是由单克隆抗体（mAb）与高活性载荷（payload）通过化学连接子偶联而成。单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中。由于其明确的靶向性、递送治疗药物的有效性，ADC 药物成为当前治疗肿瘤疾病药物的新方向。ADC 给药后在生物机体内会以多种形式存在，包括 ADC、ADC 生物转化产物、游离载荷、载荷-部分连接子及其相关代谢产物等。全面地了解 ADC 药物的药代动力学特性，对于 ADC 药物的设计和开发至关重要。
Trastuzumab deruxtecan（DS-8201; ENHERTU®）是由第一三共和阿斯利康合作开发的新型 HER2 靶向 ADC。Deruxtecan 是毒性药物 DX-8951 的衍生物（Dxd）和连接子马来酰亚胺 -GGFG 肽的偶联物，已被批准用于治疗转移性 HER2 阳性乳腺癌患者。
本文以 DS-8201 为例，利用 BioZen MagBeads 链霉亲和素磁珠提取净化方式，Biozen peptide XB-C18 分析，建立一种检测总抗体和结合型载荷的 LC-MS/MS 定量分析方法。
MagBeads 活化
取图 1. MagBeads 经过 PBS 清洗后，与生物素山羊抗人混合孵育后 PBS 清洗，磁力架弃去上清；
图 1. MagBeads 原包装
免疫捕获
加入血浆样本，混合孵育，磁力架弃去上清；
图 2. 分散清洗
淋洗和洗脱
分别使用 PBS 和碳酸氢铵溶液清洗 MagBeads，磁力架弃去上清；用 0.1% TFA 震荡洗脱，磁力架收集上清液；
图 3. 磁力架弃去上清
酶解
总抗与 Payload 分别用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解：
酶解结束后，均加入 10% FA 乙腈终止，离心待上机测试。
色谱条件
色谱柱：Biozen peptide XB-C18（2.1 × 100 mm, 1.7 μm）；P/N: 
00D-4774-AN
流动相 A 相：0.1% 甲酸水溶液；
流动相 B 相：0.1% 甲酸乙腈溶液；
流速：0.3 mL/min；
柱温：40 ℃；
质谱条件
质谱型号：SCIEX Triple Quad™ 6500系统
离子源类型：电喷雾离子源（ESI+）
扫描方式：多反应监测正负离子模式（MRM）
为获得较好的稳定性和灵敏度，优化源气参数及各化合物监测离子对、去簇电压（DP）和碰撞电压（CE）。
灵敏度和线性
用 DS-8201 配制基质曲线，该方法曲线浓度范围为 0.6nM~600nM，经过前处理后上机检测，得到总抗体和结合型 Payload 线性良好，R2 均大于 0.995（见下图 4、5）。
图 4. 总抗特征肽标准曲线
图 5. Payload标准曲线
进样曲线最高点后进空白溶液，总抗体定量肽段残留在 0.09‰，小分子 payload 残留在 0.14‰。两者残留均小于 LLOQ，满足分析要求，LLOQ 和残留色谱图见图 6~9。
图 6. 总抗特征肽 LLOQ 定量离子色谱图
图 7. 特征肽残留 XIC 色谱图
图 8. 结合型 payloadLLOQ 定量离子色谱图
图 9. Payload 空白残留 XIC 色谱图
方法回收率和基质效应
分别在大鼠血浆中添加低、中、高三个浓度 DS-8201 标品，外标法考察 MagBeads 的提取净化回收情况见下表，回收率均在 75%~90% 间。通过对比空白基质溶液添加酶解标液和空白溶剂添加酶解后标液，评估提取后基质效应得到，基质效应为 96.5%，可以得到血浆样本通过 MagBeads 提取净化后基本上没有明显的基质效应。
表 1. 加标回收结果
化合物 | 加标浓度 nM | 回收率 % |
GPSVFPLAPSSK | 1.8 | 80.2% |
180 | 82.4% | |
600 | 86.8% | |
Dxd | 1.8 | 77.3% |
180 | 82.6% | |
600 | 87.1% |
讨论
对于测定的总抗体、结合型载荷与 ADC 的生物转化，一般采用将生物基质中的所有 ADC 大分子免疫捕获出来，再进行后续酶解处理的方法。本文选择的使用通用型人源二抗对 ADC 药物进行提取捕获。根据 ADC 浓度、基质复杂程度以及其他检项的需要，还可以选择抗载荷抗体与链霉亲和素结合对偶联抗体进行捕获，从而更加提高方法的特异性和灵敏度。
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