精准检测细胞凋亡的双重标记工具

在细胞生物学研究中，细胞凋亡的检测对于揭示细胞生理和病理机制至关重要。Annexin V-EGFP/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒以其高灵敏度和特异性，为科研人员提供了一种可靠的细胞凋亡检测方法。

一、试剂盒的组成与工作原理

Annexin V-EGFP/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒主要包含 Annexin V-EGFP 和碘化丙啶（PI）。Annexin V 是一种钙离子依赖型磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸（PS）高亲和力特异性结合。在细胞凋亡早期，PS 从细胞膜内侧翻转到外侧，Annexin V-EGFP 可标记早期凋亡细胞，发出绿色荧光。PI 是一种核酸染料，无法透过完整细胞膜，但在晚期凋亡和死细胞中，PI 可进入细胞与 DNA 结合发出红色荧光。二者结合使用，可区分早期凋亡、晚期凋亡及死细胞。

二、操作使用方法

染色前准备

1. 细胞培养：根据实验要求培养细胞至适宜密度。贴壁细胞用胰蛋白酶消化，悬浮细胞直接收集。

2. 细胞洗涤：用预冷 PBS 洗涤细胞两次，去除培养基成分。300×g 离心 5 分钟，弃上清。

3. 细胞悬浮：用 Binding Buffer 悬浮细胞，调整浓度至

   $1 \times 10^5 - 1 \times 10^6 \, \text{cells/mL}$

   。

染色过程

1. 取细胞悬液：取 100 μL 细胞悬液于离心管。

2. 加 Annexin V-EGFP：按说明书加适量 Annexin V-EGFP 染色液（一般 5 μL）。

3. 加 PI 染色液：按说明书加适量 PI 染色液（一般 5 μL）。

4. 混匀与孵育：轻轻吹打混匀，室温避光孵育 15 - 30 分钟。

染色后处理

1. 洗涤去除未结合染料：用 Binding Buffer 洗涤细胞一次，300×g 离心 5 分钟，重悬细胞。

2. 流式细胞仪分析：将细胞悬液转移至流式细胞仪检测管，立即分析。Annexin V-EGFP 激发波长 488 nm，发射波长 509 nm；PI 激发波长 488 - 501 nm，发射波长 617 nm。

三、质量控制与注意事项

质量控制

试剂盒应保存于 4℃，避免光照与温度波动。每批次经严格质检，确保性能稳定。试剂盒稳定性好，可在有效期内使用。

注意事项

1. 操作环境控制：实验操作需在无菌环境进行，防止细胞污染。避免物理、化学刺激，以免影响细胞凋亡状态。

2. 染色时间优化：根据细胞类型和实验需求优化染色时间，防止染色不充分或非特异性染色。

3. 避光操作：Annexin V-EGFP 和 PI 染料光敏，操作时减少样本光照，防荧光淬灭。

4. 细胞状态监测：实验全程观察细胞状态，确保良好生理状态，异常时及时调整条件。