蛋白样品中TFA残留分析 参考USP 503.1

蛋白样品中的TFA残留是一个常见问题，主要源于多肽合成或纯化过程。残留的TFA会严重影响后续实验的准确性和可靠性，因此需要重视其残留量的检测。

参考USP 503.1标准：多肽中TFA的含量测定项下方法，使用大曹三耀2支C18色谱柱（疏水性SUPERIOREXII ODS、中等级性DAISOPAK SP-120-5-ODS-P），以及特殊官能团-金刚烷基键合的超高表面极性CAPCELL PAK ADME-HR色谱柱，对蛋白（胰岛素）及TFA混合溶液进行分析。

结果如图1、表1所示，3款不同的色谱柱均可获得胰岛素及TFA混合溶液的良好分析结果。空白溶剂无干扰，TFA保留时间均在3min左右，不对称因子小于1.3，可准确定量。

图1  TFA的各色谱柱分析谱图

表1  各色谱柱的TFA峰拖尾因子

【色谱条件】

色谱柱：CP ADME-HR S5; 4.6 × 250 mm

            DP SP-ODS-P S5; 4.6 × 250 mm

            S-II ODS S5; 4.6 × 250

流动相：A，量取7.0 mL磷酸、5.0 mL氢氧化铵，加入900 mL水中，混匀，用水稀释至1000 mL。【注】该溶液pH约为2.5。经0.45 μm孔径滤膜过滤、脱气，加入20 mL甲醇，混匀，继续脱气2分钟；B，乙腈/水 = 50/50，混匀并脱气

B% 0%(0 min) - 0%(5 min) - 100%(6 min) - 100%(14 min) - 0%(15 min) - 0%(25min)

流速：1.0 mL/min

柱温：25 ℃

检测：UV 210 nm

进样量：1 μL

浓度：TFA 1 μg/mL；胰岛素 50 μg/mL

CAPCELL PAK ADME-HR色谱柱最佳分析结果如图2所示。

图2  ADME-HR色谱柱最佳分析图

综上所述，参考USP标准：多肽中TFA的含量测定项下方法，采用CAPCELL PAK ADME-HR、DAISOPAK SP-120-5-ODS-P、SUPERIOREX II ODS色谱柱均可获得胰岛素及TFA混合溶液的良好分析结果。空白溶剂无干扰，TFA保留时间均在3 min左右，不对称因子小于1.3，可准确定量。