探索寡核苷酸杂质分离｜Shim-pack Scepter Claris液相色谱柱

具有治疗潜力的核酸和mRNA疫苗在制药工业成为新的增长点。其中寡核苷酸发展迅猛，寡核苷酸是由20到60个碱基组成的单链或双链核酸片段。包括反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰RNA （siRNA）、microRNA以及适配体。在生物化学、分子生物学和遗传学中有着广泛的应用。

寡核苷酸由于细胞外稳定性低，溶剂被核酸酶解，同时难以进入细胞等因素的影响发展缓慢，近些年，由于核酸修饰（磷酸骨架，碱基以及糖环的修饰）以及递送介质（脂质体等）等相关技术的突破，使其成为继小分子药物、抗体蛋白质药物之后，出现的一类新模式药物，是近年药物开发的热点之一。

寡核苷酸的结构决定了它极性非常强，在常规的反相色谱柱上很难保留，可以使用HILIC模式、离子交换模式或者借助于离了对试剂在反相柱上实现保留，不同分离模式各自有自己的局限性。IP-RP作为其中常用的一种，应用范围较广，今天我们从方法开发的角度一探究竟。

Part 1 方法初筛

不同离子对试剂的选择对于物质的保留差异较大。此次分析的样品是20个碱基的寡核苷酸，优先选择TEA作为离子对试剂，后期因为涉及进质谱进行质量确认，所以加入了100mmol的HFIP增加灵敏度。采用不同比例的有机相、结合不同浓度的缓冲盐浓度，优化色谱方法，得到24张色谱图，叠加如下文图1所示。

系统: Nexera XS inert

色谱柱: Shim-pack Scepter Claris C18(100 mm x2.1 mm l.D.,3 um,P/N:227-31210-05)

温度: 60°C

进样量:2 μL

流速: 0.4 mL/min

泵A

-Line A: 100 mmol/L HFlP and 20 mmol/LTEA水溶液

- Line B:100 mmol/L HFIP水溶液

-Line C: 200 mmol/L HFlP and 20 mmol/LTEA水溶液- Line D: 200 mmol/L HFIP水溶液

泵B

- Line A: 乙腈

- Line B: 甲醇

时间程序(%B):6%(0 min)>24 %(36 min)>50 %(36-37 min)>6%(37-46 min)

检测器:260 nm(SPD-M40,UHPLC惰性流通池)

质谱系统:LCMS-2050

离子源: ESI/APCI(DUISTM),负模式

扫描模式: SCAN(m/z 500-2000)

雾化器: 2.0 L/min(N2)

干燥气: 5.0 L/min(N2)加热气:7.0 L/min(N2)

DL温度:200°C

温度: 450°C

电压:-2.0 kV

整体色谱柱峰形优异，惰性化柱管对于因柱管导致的峰形拖尾等问题，改善明显。

从②⑤⑧可以看出，随着离子对试剂浓度的增加，保留提升，分离得到进一步的改善。

HFIP浓度以及有机相的比例会影响基线，200mmol/L的HFIP中有100%纯乙腈流动相会引起基线的抬升，比如⑬, ⑯, ⑲和㉒的实验结果。对比结果⑧和结果⑳，可以看出HFIP的提升，对于分离展现出不同的效果。此外，在一些文章中也提到需要在流动相中加入一定比例的HFIP，这样使得TEA的溶解度变小， 因而TEA更容易绑缚在固定相上形成更稳定的离子对试剂层 。这促使离子相互作用的分离机制非常显著，尤其针对于硫代寡核苷酸。

从②③的实验结果可以看出，不同的有机试剂含量对于杂质分离展现不同的选择性。不同流动相HFIP和TEA中的浓度、以及有机溶剂乙腈与甲醇的混合比例对FLP和FLP相关杂质分离影响较大。

最终，通过矩阵设计，考察分离效果，结果表明实验条件⑤的分离效果佳，采用的流动相条件为:100mM HFIP 10mM TEA/ACN 50%_MeOH 50%。

Part 2 方法优化

参考以上分离结果，进一步优化有机相混合比例、柱温以及梯度条件。

发现40%甲醇-60%乙腈混合比例对于寡核苷酸的分离效果更优。

文献中提到升高的柱温通常减小峰宽，从而一定程度上改善了杂质分离，因此也是主要的一个影响因素。Scepter Claris C18色谱柱采用杂化硅胶，不仅具有杂化硅胶可以耐受高柱温的特性，而且Scepter Claris色谱柱采用生物惰性涂层，相比于其他柱管的惰性化程度，惰性更优，峰形改善更明显。所以，进一步优化如图3所示，柱温65℃的峰展宽更弱，峰形更窄。

最后考察了洗脱的梯度，优化梯度条件，确定优的梯度检测条件。

最终确定了检测条件如图5所示，从图中可以发现实现从不同角度优化方法，实现了n-1、PO等杂质的良好分离。

同时，在寡核苷酸的分析检测中，除了C18色谱柱应用较多，C4色谱柱由于区别于C18的选择性，应用也非常多，常见于生物分析等。

采用岛津Nexera XS inert 系统，配套岛津全新惰性杂化硅胶色谱柱——Shim-pack Scepter Claris C18，从流动相比例、梯度、柱温等方面优化方法，避免了不锈钢柱管吸附导致的峰形问题，有效实现寡核苷酸的分离分析。结合LabSolutions MD可实现整个工作流程优化自动化，包括生成分析进度表、如自动峰值跟踪具体的数据处理功能、色谱的评价值和设计空间等，有效提升方法开发的效率。