【飞诺美色谱】生物探索 | 不同温度对单链寡核苷酸分析的影响

治疗性寡核苷酸的纯化及表征是目前制药行业的一大热点。然而，寡核苷酸的表征，特别是通过离子对反相液相色谱（IP-RPLC）进行表征，可能会非常具有挑战性。治疗性寡核苷酸是通过固相合成制造，也就是核苷酸以特定合成步骤进行循环。因此，我们必须对 n-1 和 n+1 等杂质进行表征，这其中可能需要大量的方法开发步骤来进行优化。此外，我们可能还需要对其他密切相关的杂质进行表征和定量，例如硫代磷酸酯的氧化。

另一个挑战是在寡核苷酸分析中可能会观察到的色谱的变化。保留时间、峰形和峰面积回收率可能在一个序列的进样之间变化。这些变化的一个可能原因是有会影响色谱性能的分子内相互作用。因此，我们通常会采用超过 60°C 的高温来改善分离。虽然这是处理双链寡核苷酸（如 siRNA）时的基本要求，但单链寡核苷酸是否也有必要在高温下分析是一个值得讨论的问题。在此技术笔记中，我们展示了温度对两种寡核苷酸，一种 5‘ 共轭寡核苷酸和一种硫代磷酸酯，的影响，以及如何将其用于单链寡核苷酸的方法开发过程。

图 1 说明了以 5°C 为增量增加方法运行温度的效果。和其他色谱方法类似， 5'-氨基 C12 寡核苷酸的保留时间随着温度升高而减少。通常，效率和峰形在更高的温度下会得到改善，但是在本示例中没有观察到这一点。此外，在比较 45°C 和 65°C 的杂质分布时，图中几乎没有显示出明显差异。因此，人们可能会得出结论，选择性没有受到温度的影响。

为了更好地确认选择性变化，需要使用质谱来识别和表征杂质峰。具有未知序列的 22 mer DNA 硫代磷酸酯通过高分辨率 MS 进行分析。硫代酸盐的测量质量为 6772.6 Da。我们在不同温度下进行寡核苷酸的分析，以观察杂质分析选择性的变化。

在比较 60 和 70°C 下运行的方法时（图 2），如预期所示，在较高运行温度下，主峰的保留显着降低。然而，两种方法都给出了相似的杂质谱。我们观察到了三种较早洗脱的杂质。解卷积质谱证实了相同的洗脱顺序。杂质峰1为6443.4 Da，峰2为6468.4 Da，峰3为6170.8 Da。两种运行条件下峰 1 的解卷积光谱如图 3 所示。有趣的是，峰 1 和 2 可能都是 n-1 杂质，峰 1 是目标序列减去鸟苷，峰 2 是目标序列减去胸苷。

总的来说

不同温度通常用于寡核苷酸分析的方法开发。然而，对于单链寡核苷酸，在超过 60 的温度下运行可能并没有太大提升。因为温度的升高可能不会改善色谱分离，也不会影响选择性，正如我们在其他大分子中观察到的一样。

液相色谱条件

色谱柱： bioZen™ 2.6 µm Oligo

规格： 100 x 2.1 mm （图 1）00D-4790-AN

150 x 2.1 mm （图 2,3）00F-4790-AN

流动相：图1：

A：12.5 mM HFIP, 4 mM TEA 水溶液

B：12.5 mM HFIP, 4 mM TEA甲醇溶液

图2，3：

A：100 mM HFIP, 4 mM TEA 水溶液

B：100 mM HFIP, 4 mM TEA 甲醇溶液

梯度： 5-30 % B 于14分钟内 （图1）

25-95% B于15分钟内（图2，3）

流速： 0.3 mL/min

进样量： 1uL

温度： 如图所示

检测器： UV@260nm（图1，2）

TOF-MS（图3）

样品： 5‘-氨基C12 寡核苷酸（图1）

DNA 22mer硫代磷酸酯（图2，3）

图1：温度对 5'-氨基 C12 寡核苷酸的影响

图2：22 mer DNA 硫代磷酸酯的杂质谱图

图3：杂质峰 1 的解卷积谱图